何时高压灭菌，何时过滤除菌

细胞培养的核心之一是无菌操作。那么，菌从何而来？

从人、物品以及环境中来。

使用一次性、已灭菌的实验工具能有效降低污染引入的风险，但总有一些工具、总有一些环节是需要反复使用的，而这就需要进行清洁和灭菌。

常见的2种操作是高压灭菌和过滤除菌。

本期内容主要讲一下这两者的区别和注意事项。

选择灭菌方法的基本原则

灭菌方法的选择主要基于物品在高温下的稳定性。

可抗高温的物品，例如玻璃、金属、耐热塑料（PTFE），可采用干热灭菌；热稳定的液体可以采用湿热灭菌，也就是高压蒸汽灭菌；热敏感的素材可以用乙醇或射线灭菌；热不稳定的液体可以采用过滤除菌。

高压灭菌简介

常间的高压灭菌方法是使用灭菌锅加热水提高温度和压力来完成。

其实验条件是将实验工具所处的环境加热至121摄氏度，并维持至少20分钟。由于水蒸气会渗透至整个空间，灭菌结束后需要有一个干燥的过程。

高压蒸汽灭菌适用于热稳定的液体，例如水、盐溶液、或一些成份对热稳定的培养基，例如LB。

同时，这种方法也适用于耐热的塑料，不少离心管、移液器、吸头、吸头盒都是可以通过高压来灭菌的。

使用高压灭菌需要注意2点：

1 将含有液体的玻璃器皿进行灭菌，如果其使用塑料盖密封，应在灭菌前拧松盖子，以防灭菌过程发生爆炸；

2 如果实验工具需要后续用于无菌操作实验，建议灭菌锅所用的水使用无菌的超纯水，因为灭菌过后，锅内有可能存在凝结水，而后者可能会存在污染带入的风险。

过滤除菌简介

对于不耐热的液体，可以使用孔径为0.1-0.2um的微孔过滤器除菌。

过滤的方法分为正压过滤和负压过滤，区别在于正压过滤大多通过外力推压针筒，使目标液体通过滤器的滤膜后，杂质或污染物留在膜上，液体过滤至新的容器内。

负压过滤是通过将容器外接一个泵，利用泵把容器内的空气抽走，实现一个负压的状态，而液体则从容器上方往下透过滤膜流入容器内。

使用过滤除菌，同样有几点要注意：

1 从操作上看，使用负压过滤会简单不少，但由于泵在抽走空气的同时，也会带走容器内的二氧化碳，因此过滤后的溶液所处的环境的pH会提高。

如果是一些对后续实验有pH要求的液体，应该视情况补充二氧化碳进容器内。

2 不管是正压还是负压，都需要对滤器进行质控检测，确保滤膜的完整性。这个质控操作有一个专有名词，叫起泡点试验。

具体操作是：当正压过滤完成后，所有液体已通过滤器时，提高压力直至滤器流出物中形成气泡，这就叫起泡点 (bubble point)。

它会在压力是过滤压力的两倍多时出现，过滤压力的数值可以参考产品说明书。

如果滤器在灭菌压力(100kPa)或更低压力时出现起泡，那么代表该滤膜已经穿孔。

在这种情况下，任何已经收集的滤出液都应该被认为是未灭菌的，需要重新过滤。同时应更换滤膜。

3 有一些化学溶液会溶解滤膜，因此，如果要使用过滤除菌的话，应该要提前检查滤膜材质是否能兼容这种化学溶液。